1，你的质粒没有完全切开，可能还有完整的空载混在连接产物里面。这和你酶切的效率有关，考虑酶的质量、浓度、和酶切时间。甚至可能是单酶切的结果。2， 切下来的多克隆位点，你没有成功的分离出去，还混在你的连接体系里面，这样的话有一定的概率会重新连接回去。3，你的插入片段加入的不够，要在mol值上是质粒的三倍以上才好，否则的话，连接效率可能不高。4，说真的，这个过程中出什么结果都有可能，所以转化之后要测序才可以。
